調(diào)節(jié)pH值對(duì)于維持細(xì)胞環(huán)境中的健康平衡是至關(guān)重要的。在生物體系中,pH值變化可能是生物系統(tǒng)中疾病和功能障礙的結(jié)果。因而,pH的檢測(cè)是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。在細(xì)胞水平上pH偏差的出現(xiàn)可能意味著異常反應(yīng)和疾病。例如,腫瘤細(xì)胞外的pH值相對(duì)于正常細(xì)胞偏酸性。這是由于癌細(xì)胞的代謝方式導(dǎo)致了乳酸的產(chǎn)生,增加了局部H+的活性。因此,監(jiān)測(cè)細(xì)胞外pH是至關(guān)重要的。

掃描電化學(xué)顯微鏡的超微電極尖端通過(guò)精密定位到感興趣的樣品表面,可以觀察到樣品表面局部電化學(xué)活性。掃描電化學(xué)顯微鏡已應(yīng)用于生物體系。例如,活細(xì)胞和固定化的生物分子(抗體、DNA片段)等。而電位法中的固態(tài)離子選擇性電極具有操作簡(jiǎn)單,不會(huì)改變?nèi)芤旱某煞值葍?yōu)點(diǎn)得到廣泛關(guān)注。


利用固態(tài)離子選擇性電極作為掃描電化學(xué)顯微鏡的探針,可以檢測(cè)H+、堿金屬和堿土金屬離子等。因此,掃描電化學(xué)顯微鏡為檢測(cè)細(xì)胞外pH提供了有用的工具。


本論文通過(guò)制備掃描電化學(xué)顯微鏡探針并利用掃描電化學(xué)顯微鏡電位法,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞外pH的監(jiān)測(cè)。本論文的研究?jī)?nèi)容分為四章,具體內(nèi)容如下:


第一章緒論本章先介紹了掃描電化學(xué)顯微鏡的基本原理、工作模式和應(yīng)用。然后介紹了細(xì)胞外pH的檢測(cè)方法和電刺激對(duì)于細(xì)胞的影響。最后提出了本論文的研究意義和目的。


第二章掃描電化學(xué)顯微鏡電位法中的聚苯胺固態(tài)pH選擇性微電極探針的制備在這一章中,制備了以鉑微電極為基質(zhì)的聚苯胺固態(tài)pH選擇性微電極,并把該pH選擇性微電極用作掃描電化學(xué)顯微鏡探針,用于監(jiān)測(cè)溶液的pH。pH選擇性微電極通過(guò)在含有苯胺的鹽酸溶液中以-0.1+0.9V的電位循環(huán)沉積聚苯胺薄膜而得到的。聚苯胺薄膜的制備、穩(wěn)定性和可逆性被表征和優(yōu)化。該pH選擇性微電極與Ag/AgCl參比電極之間的電動(dòng)勢(shì)信號(hào)至少在pH為4.00~8.00范圍內(nèi)呈線性響應(yīng),斜率為53.0±0.4 mV/pH,具有良好的可逆性,響應(yīng)時(shí)間為10s,持續(xù)3 h的測(cè)定電位漂移為1.13%,可用于檢測(cè)溶液的pH。


第三章掃描電化學(xué)顯微鏡雙電極探針的制備以及對(duì)細(xì)胞外pH實(shí)時(shí)測(cè)定的應(yīng)用在本章中,我們研究了一種制備雙電極作為掃描電化學(xué)顯微鏡探針的方法。雙電極是通過(guò)封裝法將金/鉑絲密封在拉制的硼硅酸玻璃管,并通過(guò)循環(huán)伏安法、掃描電子顯微鏡技術(shù)等方法驗(yàn)證了該雙電極的成功制備。將聚苯胺薄膜修飾在雙電極中的鉑微電極上用以制備pH選擇性微電極并應(yīng)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞人包皮成纖維細(xì)胞HFF和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的細(xì)胞外pH(pHe)。雙電極中的金微電極通過(guò)逼近曲線來(lái)確定雙電極與細(xì)胞之間的距離,雙電極的pH選擇性微電極利用電位法實(shí)現(xiàn)pH測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了人包皮成纖維細(xì)胞的pHe高于乳腺癌細(xì)胞的pHe,這可能是因?yàn)檎<?xì)胞和癌細(xì)胞代謝方式的不同。該研究方法為研究pHe提供了新的思路。


第四章利用掃描電化學(xué)顯微鏡電位法監(jiān)測(cè)電刺激后細(xì)胞外pH的變化在本章中,雙電極作為掃描電化學(xué)顯微鏡探針并利用掃描電化學(xué)顯微鏡電位法監(jiān)測(cè)電刺激細(xì)胞之后的細(xì)胞外pH(pHe)的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著雙電極離細(xì)胞的距離的減少,pHe也在減少。并隨著刺激電位的增大和刺激時(shí)間的增加,pHe逐漸減少。


通過(guò)鈣黃綠素-AM和碘化丙啶的熒光染色結(jié)果驗(yàn)證了這種現(xiàn)象是由于電刺激細(xì)胞使得細(xì)胞膜通透性變大的原因。比較了三種不同細(xì)胞在電刺激之后的pHe的大小,得到了pHe的比較順序?yàn)镸CF-7<HFF<Hela。為細(xì)胞在電刺激狀態(tài)下,監(jiān)測(cè)不同距離下的pHe提供了重要的技術(shù)支持。