結(jié)果


溫度和沉積層對(duì)沉積物中不同種類(lèi)微囊藻菌落存活的影響


微電極分析表明,含有微囊藻菌落的表層為需氧層,深層為厭氧層(支持材料中的圖S1)。


微囊藻菌落在不同沉積條件下的存活能力如圖2所示。通過(guò)三因素重復(fù)方差分析,分析了溫度、微囊藻種類(lèi)和沉積層對(duì)微囊藻菌落存活的影響。溫度是顯著影響底棲微囊藻菌落存活的唯一因素(P<0.001,表1)。具體而言,25°C的溫度對(duì)長(zhǎng)期存活不利,如相應(yīng)的事后測(cè)試所示。此外,存在顯著的溫度-層相互作用(P=0.003),表明層間差異取決于所討論的溫度,反之亦然。三次重復(fù)的單因素方差分析顯示,在15°C(P=0.007)和25°C(P<0.001)時(shí),沉積物深層微囊藻菌落的存活率顯著大于表層微囊藻菌落的存活率,而在5°C時(shí),微囊藻菌落的存活率無(wú)顯著差異(P=0.260)。在5°C時(shí),衛(wèi)森伯格支原體的存活率顯著高于銅綠支原體(P=0.018)。然而,在15°C和25°C時(shí),衛(wèi)森伯格支原體和銅綠支原體的存活率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P=0.740和0.981)。



圖2不同溫度下沉積物表層和深層微囊藻菌落的存活率,表示為存活百分比:5℃下銅綠微囊藻a、5℃下魏森伯格微囊藻b、5℃下微囊藻C、15℃下銅綠微囊藻d、15℃下魏森伯格微囊藻e(cuò)、15℃下微囊藻f、25℃下銅綠微囊藻g,h M.wesenbergii在25°C下,i.微囊藻在25°C下。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)前結(jié)果,針對(duì)不同的溫度設(shè)置了不同的采樣間隔


如表1所示,時(shí)間的處理內(nèi)效應(yīng)以及時(shí)間與三個(gè)因素(溫度、微囊藻種類(lèi)和層數(shù))之間的關(guān)系都是顯著的,表明沉積物中存活微囊藻細(xì)胞的密度隨時(shí)間而變化。此外,變化模式因微囊藻種類(lèi)、溫度和沉積層而異。因此,通過(guò)單因素重復(fù)方差分析和Tukey事后檢驗(yàn),分別研究了不同沉積條件下不同微囊藻群的變化規(guī)律。


表1重復(fù)測(cè)量了14周內(nèi)溫度(5、15和25°C)和沉積層(表層和深層)對(duì)不同種類(lèi)微囊藻菌落(銅綠假單胞菌、魏森伯格微囊藻和這兩種微囊藻的1:1混合物)存活率影響的方差分析


在5°C溫度下,沉積物表層和深層中存活的銅綠假單胞菌的豐度在前18周內(nèi)沒(méi)有顯著變化,僅在第22周下降(分別為P=0.048和0.044)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,表層魏森伯格支原體和微囊藻的豐度沒(méi)有顯著差異(分別P=0.134和0.191)。在深層,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,細(xì)胞數(shù)量具有可比性,但衛(wèi)森伯格支原體在第18周(P=0.020)和混合微囊藻菌落在第10周(P=0.003)除外。當(dāng)比較初始(第0周)和最終(第22周)細(xì)胞密度時(shí),僅發(fā)現(xiàn)表層中的銅綠假單胞菌存在顯著差異。


在15°C下,在初始滯后期后,表層微囊藻豐度的減少變得相當(dāng)迅速,此后從第12周到試驗(yàn)期結(jié)束,存活率穩(wěn)定在約25%。銅綠微囊藻的滯后期為4周(第4周與第6周的P值為0.015),而威森伯格微囊藻的滯后期為2周(第4周與第6周的P值為0.013)。在深層,所有三個(gè)系列的微囊藻菌落在前8周保持穩(wěn)定,僅在第8周至第12周(銅綠假單胞菌)或第14周(維森貝格氏微囊藻菌落和混合微囊藻菌落)出現(xiàn)明顯損失。隨后,未發(fā)現(xiàn)顯著下降,試驗(yàn)結(jié)束時(shí),所有三個(gè)系列的微囊藻的存活率均保持在50%以上(銅綠假單胞菌為64.58%,韋森貝基微囊藻為59.22%,混合微囊藻菌落為50.80%)。


在25°C下,所有三個(gè)微囊藻系列的動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)2周的滯后期后,表層微囊藻的存活率降至接近零,直到第12周。在深層,5周的滯后期顯著延長(zhǎng)。銅綠假單胞菌和混合微囊藻菌落的存活率在第14周降至接近零,而衛(wèi)森伯格假單胞菌的存活率在第12周降至接近零。


底棲微囊藻群體中微囊藻毒素總含量和微囊藻毒素配額的動(dòng)態(tài)


計(jì)算并比較了沉積物中微囊藻菌落的總MC含量。MCLR和MC-RR的濃度在所有條件下均表現(xiàn)出良好的相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)性,N=192,R=0.980,P<0.001)(圖3)。因此,在本研究中,我們沒(méi)有將它們分開(kāi),而是將它們統(tǒng)稱(chēng)為BMC^。我們比較了三組微囊藻菌落的存活率:毒性銅綠假單胞菌、無(wú)毒魏森伯格微囊藻菌落和兩種微囊藻的1:1混合物(表示為微囊藻屬)。僅分析了銅綠假單胞菌和微囊藻組的MC含量。MC含量的動(dòng)態(tài)表現(xiàn)在兩個(gè)層面:表層或深層沉積物中所有存活微囊藻菌落的MC總含量和MC配額,其計(jì)算方法為總MC含量除以細(xì)胞計(jì)數(shù)的商。微囊藻群的MC配額可能受到銅綠假單胞菌和威森伯格假單胞菌豐度比的影響。因此,僅使用銅綠假單胞菌的MC配額來(lái)反映每個(gè)細(xì)胞間MC含量的變化(圖4)。

圖3 5°C下銅綠假單胞菌a和微囊藻PP沉積物表層和深層微囊藻菌落中MC-RR總含量的動(dòng)態(tài)。在5°C下,銅綠假單胞菌在15°C下,d微囊藻PP。在15°C下,銅綠假單胞菌在25°C下,微囊藻屬在25°C下。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)前結(jié)果,針對(duì)不同的溫度設(shè)置了不同的采樣間隔

圖4 5°C(a)、15°C(b)和25°C(C)條件下沉積物表層和深層中銅綠假單胞菌的微囊藻毒素配額。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)前結(jié)果,針對(duì)不同的溫度設(shè)置了不同的采樣間隔


溫度和沉積層顯著影響沉積物中微囊藻菌落的總MC含量(表2)。在較低溫度下,微囊藻菌落的總MC含量在深層顯著較高。此外,存在顯著的溫度-層相互作用(P=0.003),表明層間差異因溫度而異。


表2重復(fù)測(cè)量溫度(5、15和25°C)和沉積層(表層和深層)對(duì)微囊藻菌落(銅綠假單胞菌、1:1的銅綠假單胞菌和韋森伯格假單胞菌混合物)MC-RR總含量影響的方差分析

在不同溫度下分別進(jìn)行單向重復(fù)方差分析和Tukey的事后檢驗(yàn)。在5°C下,整個(gè)試驗(yàn)期間,銅綠微囊藻和混合微囊藻菌落中的MC總含量沒(méi)有顯著差異(表層銅綠微囊藻,P=0.062;表層微囊藻屬,P=0.065;深層銅綠微囊藻,P=0.137;深層微囊藻屬,P=0.087)。通過(guò)兩兩比較,第22周表層菌落的總MC含量顯著低于其他采樣日期。在15°C和25°C時(shí),銅綠假單胞菌中的總MC含量在實(shí)驗(yàn)期間顯著下降(P<0.05)。在15°C的深層,銅綠假單胞菌和微囊藻菌落的總MC含量在前8周保持穩(wěn)定(銅綠假單胞菌,P=0.167;微囊藻,P=0.088),并從第10周到實(shí)驗(yàn)結(jié)束顯著下降。在15°C的表層中,MC的總含量在第二周或第四周開(kāi)始顯著降低,在其余的實(shí)驗(yàn)期間,這種降低趨勢(shì)持續(xù)。在25°C時(shí),銅綠假單胞菌和微囊藻菌落的總MC濃度在前5周迅速下降,隨后在表層和深層均保持較低水平。表層銅綠假單胞菌細(xì)胞中MC濃度顯著低于深層銅綠假單胞菌(P<0.001)。


溫度和沉積層顯著影響綠膿桿菌的MC配額(P<0.001,表3)。在較高溫度(25°C)和表層,銅綠假單胞菌的微囊藻毒素配額顯著降低。時(shí)間的內(nèi)處理效應(yīng),以及時(shí)間與溫度和層之間的關(guān)系都是顯著的。


表3重復(fù)測(cè)量了14周內(nèi)溫度(5、15和25°C)和沉積層(表層和深層)對(duì)銅綠假單胞菌微囊藻毒素配額影響的方差分析


對(duì)每個(gè)溫度進(jìn)行單因素方差分析和Tukey的事后檢驗(yàn)。與三因素方差分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果不同,根據(jù)單因素方差分析(5°C,P=0.062;15°C,P=0.449;和25°C,P=0.371),兩層沉積物中銅綠假單胞菌的MC配額之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。在5°C時(shí),第一周銅綠假單胞菌的MC配額與第6、第10和第22周的MC配額相當(dāng),但顯著低于或高于第2、第14和第18周的MC配額。在15°C時(shí),只有第2周和第14周的MC配額與初始值顯著不同。在5°C和15°C下采集的樣品中,銅綠假單胞菌的MC配額沒(méi)有顯著差異。雖然在一些采樣日期存在波動(dòng),但微囊藻毒素配額在5°C和15°C下在表層和深層沉積物中基本穩(wěn)定。在25°C下,任何采樣日期的MC配額都明顯低于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)。


沉積物中微囊藻群體光合活性的動(dòng)態(tài)


使用三因素重復(fù)方差分析測(cè)試分析溫度、微囊藻種類(lèi)和層數(shù)對(duì)微囊藻菌落Fv/Fm的影響(圖5)。溫度和沉積層顯著影響底棲微囊藻菌落的Fv/Fm(P<0.01,表4)。在所有沉積條件下,微囊藻的Fv/Fm逐漸降低,在較高溫度(P<0.001)和表層(P=0.002)下,F(xiàn)v/Fm的下降百分比增加。毒性銅綠假單胞菌和無(wú)毒韋森伯格假單胞菌的Fv/Fm無(wú)顯著差異(P=0.320)。


圖5不同溫度下沉積物表層和深層微囊藻的有效量子產(chǎn)率(單位:PSII(Fv/Fm))。銅綠假單胞菌在5°C時(shí),銅綠假單胞菌在5°C時(shí),銅綠假單胞菌在5°C時(shí),銅綠假單胞菌在15°C時(shí),銅綠假單胞菌在15°C時(shí),銅綠假單胞菌在15°C時(shí),銅綠假單胞菌在25°C時(shí),銅綠假單胞菌在25°C時(shí),銅綠假單胞菌在15°C時(shí),銅綠假單胞菌在15°C時(shí),銅綠假單胞菌在15°C時(shí),銅綠假單胞菌在25°C時(shí),銅綠假單胞菌在25°C時(shí),銅綠假單胞菌在25°C時(shí),銅,根據(jù)我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果


表4重復(fù)測(cè)量了14周內(nèi)溫度(5、15和25°C)和沉積層(表層和深層)對(duì)綠膿桿菌光合活性影響的方差分析


治療時(shí)間內(nèi)的療效顯著。微囊藻菌落的豐度開(kāi)始下降之前有一段滯后期。然而,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,F(xiàn)v/Fm值顯著降低。時(shí)間與三個(gè)因素(溫度、微囊藻種類(lèi)和層)之間的關(guān)系顯著,表明下降速度受微囊藻種類(lèi)、溫度和沉積層的影響。


討論


在這項(xiàng)研究中,我們考察了在受控實(shí)驗(yàn)室條件下,考慮溫度和氧氣的影響,底棲微囊藻菌落的存活能力。我們不打算在不同溫度下模擬底棲微囊藻群落的整個(gè)壽命,因?yàn)闇\水湖泊中沉積物的溫度是周期性的,并隨季節(jié)變化。相反,我們采用了為期4-6個(gè)月的模擬試驗(yàn)來(lái)評(píng)估底泥中微囊藻菌落的存活能力。


在5°C條件下,表層和深層沉積物中的微囊藻菌落豐度在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(第22周)沒(méi)有顯著減少,表層中的銅綠假單胞菌除外。在15°C和25°C時(shí),沉積物中微囊藻菌落的豐度在初始滯后期后迅速下降,隨后存活率穩(wěn)定下來(lái),直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。物流模型(方程式1)大致符合沉積物中微囊藻菌落在15°C和25°C下存活百分比的動(dòng)態(tài):


其中t、y、t0和p分別代表采樣時(shí)間、沉積物中微囊藻的存活百分比、中心時(shí)間和功率。A1和A2代表存活率穩(wěn)定的初始值和最終值。通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù),得到了變化過(guò)程的開(kāi)始時(shí)間和結(jié)束時(shí)間,分別用t1和t2表示。也就是說(shuō),微囊藻細(xì)胞的存活率在t1的初始滯后期后開(kāi)始下降,此后存活率從t2到試驗(yàn)期結(jié)束穩(wěn)定在A2(表5)。


表5根據(jù)邏輯模型計(jì)算的15或25°C條件下不同沉積物層中微囊藻菌落的存活百分比


較大的初始延遲時(shí)間(t1)和最終存活率(A2)可以反映較高的存活率。由于在5°C下22周的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何顯著的下降,t1和A2可分別被視為22周和100%。通過(guò)比較不同條件下微囊藻菌落的t1和A2,我們得出以下結(jié)論:(1)低溫有利于微囊藻菌落在沉積物中更長(zhǎng)的存活時(shí)間,(2)銅綠假單胞菌的最終存活百分比(表5中的A2)在15℃和25℃時(shí)高于衛(wèi)森伯格微囊藻,深層微囊藻的存活率顯著高于表層微囊藻。微囊藻菌落的存活能力可與植物種子的存活能力相比較,植物種子埋在土壤中時(shí),可作為下一季萌發(fā)的種子庫(kù);硬殼種子可以在土壤中存活數(shù)十年,同時(shí)在適當(dāng)條件下保持發(fā)芽能力。因此,沉積微囊藻菌落也可以被認(rèn)為是一種種子庫(kù);在野外條件下,微囊藻形成由數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)細(xì)胞組成的菌落,細(xì)胞被厚厚的鞘覆蓋。就像種子的外殼一樣,微囊藻菌落的鞘可以保護(hù)微囊藻細(xì)胞免受不利的底棲條件的影響。低溫和厭氧條件促進(jìn)了種子和底棲微囊藻群體的長(zhǎng)期存活(Andrade,2001年)。


溫度是影響沉積物中微囊藻菌落存活的最重要因素。在5°C溫度下22周的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,微囊藻數(shù)量幾乎沒(méi)有顯著減少,而在25°C溫度下,超過(guò)90%的底棲生物種群在3個(gè)月內(nèi)消失。這些結(jié)果與現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查結(jié)果一致。例如,微囊藻菌落可以在格蘭根特湖(法國(guó))的沉積物中存活長(zhǎng)達(dá)6年,那里的溫度總是低于10℃(Misson等人,2012a)。在德國(guó)Quitzdorf水庫(kù)的另一個(gè)湖泊的沉積物中,當(dāng)溫度在再侵入階段持續(xù)高于12°C時(shí),65%到85%的底棲微囊藻群落死亡(Ihle等人,2005年)。本研究定量揭示了沉積物中微囊藻菌落的存活情況。根據(jù)我們的研究結(jié)果和亞熱帶淺水湖泊溫度的實(shí)際季節(jié)變化,大多數(shù)底棲微囊藻群落能夠成功越冬,因此有可能在第二年春天接種水柱,但它們不能在亞熱帶淺水湖泊的沉積物中積累多年。


氧氣水平是決定底棲微囊藻菌落存活的另一個(gè)因素。微囊藻菌落在好氧表層沉積物中的存活率顯著低于厭氧深層沉積物。如表1所示,在15°C下放置17周后,上層沉積物中微囊藻菌落的豐度下降,存活率低于20%,而深層沉積物中的種群減少率低于50%。其他研究人員也報(bào)告說(shuō),沉積物表層中有更高比例的微囊藻菌落消失(Brunberg和Blomqvist,2002年;Ihle等人,2005年),這可能是再侵入和細(xì)胞溶解的結(jié)果。其他藍(lán)藻,如圓柱狀振蕩藻,也對(duì)氧敏感,在還原條件下比有氧條件下存活更長(zhǎng)(Richardson和Castenholz 1987)。


毒性銅綠假單胞菌和無(wú)毒維森伯格假單胞菌具有相似的存活能力,盡管銅綠假單胞菌在15°C和25°C下的最終存活效率(表5中的A2)高于維森伯格假單胞菌。一些研究人員發(fā)現(xiàn),MCs可能參與了底棲微囊藻的存活機(jī)制。因此,有毒微囊藻菌落可能比無(wú)毒菌落更容易越冬(Ihle等人,2005年;Misson等人,2012a)。然而,在我們的研究中,毒性銅綠假單胞菌和無(wú)毒維森伯格假單胞菌的存活率沒(méi)有顯著差異。覆蓋鞘的厚度可能是影響微囊藻生存能力的關(guān)鍵因素。在沉積物中,有鞘光養(yǎng)生物比無(wú)鞘光養(yǎng)生物壽命更長(zhǎng)(J?rgensen等人,1988年)。銅綠假單胞菌的鞘比維森伯格假單胞菌的鞘薄得多。因此,有毒銅綠假單胞菌中的MC可能有利于其長(zhǎng)期存活。然而,這一優(yōu)勢(shì)可能被銅綠假單胞菌較薄的鞘層所抵消。在另一項(xiàng)研究中,在沉淀物中埋藏6年和33年的底棲微囊藻種群之間,未發(fā)現(xiàn)有毒和無(wú)毒細(xì)胞比例的顯著差異(Rinta Kanto等人,2009年)。需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示細(xì)胞內(nèi)MC在底棲微囊藻菌落存活中的生理作用。


在5℃和15℃下,微囊藻細(xì)胞中的MC含量在實(shí)驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定。因此,可以推斷,在黑暗條件下,沉積物中不會(huì)產(chǎn)生MCs。此外,底棲微囊藻保存的MCs沒(méi)有作為碳源消耗或釋放到周?chē)h(huán)境中。然而,在25°C時(shí),微囊藻細(xì)胞的MC配額顯著降低。在此溫度下,微囊藻細(xì)胞的光合活性顯著降低。微囊藻細(xì)胞膜也可能受損,細(xì)胞間MC可能從細(xì)胞中釋放,導(dǎo)致MC配額下降。Wu等人(2015年)還發(fā)現(xiàn),新鮮藍(lán)藻樣本中的細(xì)胞內(nèi)MC在細(xì)胞破裂之前不會(huì)迅速減少。對(duì)于野生樣本,微囊藻種群包括有毒和無(wú)毒兩種形式。因此,現(xiàn)場(chǎng)樣本中MC配額的波動(dòng)可能主要取決于有毒和無(wú)毒細(xì)胞的相對(duì)比例,而不是有毒細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)MC含量水平。在我們的研究中,定量測(cè)定了群體微囊藻菌株純培養(yǎng)物中細(xì)胞內(nèi)MC的動(dòng)態(tài),從而消除了群落組成的任何潛在影響,并提供了更具針對(duì)性的結(jié)果。底棲微囊藻群體的光合活性逐漸下降,在較高溫度下下降幅度較大。我們的研究結(jié)果和其他研究結(jié)果表明,在沒(méi)有光照的情況下,沉積物中PSII的光化學(xué)效率逐漸降低(Sch?ne等人,2010)。當(dāng)溫度低于15°C時(shí),毒性細(xì)胞和無(wú)毒細(xì)胞的存活率沒(méi)有顯著差異,細(xì)胞內(nèi)含量穩(wěn)定。因此,在越冬和再入侵期間,底棲微囊藻種群的毒性沒(méi)有顯著變化。


結(jié)論


在這項(xiàng)研究中,我們系統(tǒng)地研究了微囊藻菌落在表層和深層沉積物中,在不同季節(jié)對(duì)應(yīng)的不同溫度下的存活能力。低溫和厭氧條件促進(jìn)了底棲微囊藻菌落的長(zhǎng)期存活。毒性銅綠假單胞菌和無(wú)毒魏森伯格假單胞菌表現(xiàn)出相似的存活能力,在實(shí)驗(yàn)期間,底棲微囊藻細(xì)胞的MC含量在5℃和15℃下保持穩(wěn)定。因此,在越冬和再入侵期間,底棲微囊藻種群的毒性沒(méi)有顯著變化。我們的研究表明,大多數(shù)底棲微囊藻群體能夠成功越冬,微囊藻毒素得以保存,光合活性得以維持,顯著增加了水華形成的風(fēng)險(xiǎn)。因此,需要采取疏?;蚋采w沉積物等人工措施,以避免沉積物中累積微囊藻菌落的不利影響。在夏季,當(dāng)亞熱帶淺水湖泊的溫度較高(例如25°C)時(shí),底棲生物種群的存活率在3個(gè)月內(nèi)降至接近零。因此,底棲微囊藻種群不能在亞熱帶淺水湖泊的沉積物中積累多年。


致謝


中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金(31270509和31370504)、中國(guó)水污染防治與治理重大科學(xué)技術(shù)計(jì)劃(2013ZX07102005)、國(guó)家淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2016FB10)等國(guó)家科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41561144008和)。作者感謝有害藻類(lèi)團(tuán)隊(duì)的所有成員,特別是中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所的李仁輝教授,感謝他們對(duì)微囊藻菌株的純培養(yǎng)和儀器的幫助。我們還要對(duì)袁曉博士(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所分析測(cè)試中心)的儀器支持表示最深切的感謝。