熱線:021-66110819,13564362870
Email:info@vizai.cn
熱線:021-66110819,13564362870
Email:info@vizai.cn
隨著高通量測序技術(shù)飛速發(fā)展,人們對微生物的認知也在逐漸深入。凌恩生物每天都會接到全國各類型微生物測序樣本,上到山巔土壤,下至深海底泥;有老師研究植物根際和葉內(nèi)微生物,也有老師關(guān)注動物昆蟲腸道生理代謝的奧秘。為了得到能夠研究的測序結(jié)果,規(guī)范標準的取樣及送樣是成功的前提。
在樣本送測前,我們要注意以下幾點:
1、取樣使用的工具及容器必須經(jīng)過滅菌處理;
2、取樣后及時做好標記,記錄取樣相關(guān)信息;
3、樣本送測前做好備份,防止意外發(fā)生丟失珍貴樣本;
4、送測樣本使用標準容器承裝,在容器上標記清晰,送樣不宜過多;
5、寄送時保持低溫環(huán)境,建議使用干冰配送;
6、可使用凌恩微生態(tài)樣本保真液,高品質(zhì)樣本是決定高品質(zhì)研究成果的第一步。
常規(guī)土壤類樣本取樣方法-農(nóng)田/森林/草原土壤等
(1)取樣方法
按實驗設(shè)計確定采樣范圍,取樣器具需事先消毒滅菌處理。采樣時應去除地表雜質(zhì),根據(jù)需要挖取相應深度(如5~20 cm)的土壤,置于冰上運至實驗室。去除可見雜質(zhì),建議過2 mm無菌篩網(wǎng)。同一樣方多點樣本等量混合均勻后取5~10 g,保存無菌EP管中,進行核酸提取,或-80℃保存?zhèn)溆?。若不能自行提取,可置于干冰寄送至公司?
注:建議戴一次性手套、口罩,進行嚴格取樣和操作,盡可能減少人為的污染。
根際土壤樣本取樣方法-作物/蔬菜/草木根系等
(1)作物類(含草地等矮小植物)根際土壤取樣方法
a.采集植物植株,去除根部大塊土壤,置于冰上運輸至實驗室;
b.晃動根部,去除根部松散的土壤后,使用無菌刷子從根部收集殘留土壤;
c.同一樣方多點取樣土壤樣本等量混合均勻后,液氮速凍,置于-80℃冰箱保存。
(2)林木類根際土壤取樣方法
a.采集地面下10-20 cm根際土壤,置于冰上運輸至實驗室;
b.過2-5 mm孔徑無菌篩網(wǎng);
c.同一樣方多點取樣土壤樣本等量混合均勻后,液氮速凍,置于-80℃冰箱保存。
若不能自行提取,可置于干冰寄送至公司提取。
注:取樣器具請事先消毒滅菌處理。若為真菌根際土壤,請務必盡可能去除菌絲體殘留,減少對DNA/RNA提取的干擾。
植物表面微生物取樣方法?
(1)取樣方法
依據(jù)實驗設(shè)計,進行樣方設(shè)置,每一樣方進行多點取樣,同一樣方點等量混勻成一個樣本。植物根部組織可以通過搖晃振蕩或無菌刷子去除根表粘附土壤。
(2)樣本前處理
將植物組織浸沒于無菌PBS溶液,180rpm孵育20min;取出植物組織,再次加入無菌PBS溶液,180rpm孵育20min,取出植物組織,再次加入無菌PBS溶液,超聲波洗滌10min(參數(shù):160 W,30s/30s),最后取出植物組織至于-80度冰箱保存?zhèn)溆谩?
將三次洗滌液匯總,過0.2um濾膜(或12000g離心10min,收集沉淀),收集濾膜至于-80度冰箱保存。
植物內(nèi)部微生物取樣方法
(1)依據(jù)實驗設(shè)計,進行樣方設(shè)置,每一樣方進行多點取樣,同一樣方點等量混勻成一個樣本。
(2)對植物組織進行表面消毒操作或者使用上一步“植物表面微生物取樣”中處理過的植物組織,液氮速凍后,研磨成粉,即可用來進行核酸的提取。
植物組織表面消毒具體操作如下:
無菌水洗滌30s,70%無菌乙醇洗滌2min,2,5%NaClO(含0.1%Tween 80)浸泡5min后轉(zhuǎn)移至70%無菌乙醇浸泡30s,最后使用無菌水洗滌植物組織3次,即視為對植物組織表面進行無菌化。
表面無菌化的植物組織至于-80度冰箱保存?zhèn)溆没蜻M行核酸提取。
植物根表面微生物取樣方法
(1)將所研究的物體放在事先滅好的無菌容器當中;
(2)加入PBS緩沖液后進行振蕩,使得微生物從物體表面充分的脫落并聚集在PBS緩沖液當中,震蕩至少2h以上;
(3)直接提取PBS緩沖液中的微生物或者將緩沖液用濾膜過濾之后再進行DNA的提取。
PBS濃度和PH有要求:濃度是用1x的,PH值是7.4,一般買回來的PBS是10x的,建議稀釋到1x。
注意:建議優(yōu)先使用超聲波洗滌。
空氣樣本微生物取樣方法
使用空氣抽濾機,使空氣通過0.22μm濾膜,濾膜上有可見覆蓋物(過濾時間越長,收集的空氣中的灰塵越多,菌數(shù)量越多),收集完成后取下濾膜。濾膜置于凍存管中,液氮速凍,干冰寄送到實驗室。
注意:由于樣本特殊,微生物含量較少,建議多保管備份保存。
水體樣本微生物取樣方法
送樣量:擴增子直徑3-4cm濾膜1-2張;宏基因組直徑3-4cm濾膜>=2張;
(1)研究目的進行確定水體的取樣深度和范圍;
(2)采樣后進行濾膜過濾,選擇合適孔徑的濾膜,對于澄清水體或者略渾濁水體,選用0.22μm或者0.45μm的濾膜,取樣體積大于5L;對于渾濁水體,建議先用大孔徑的濾膜過濾一遍,再用小孔徑的濾膜過濾;
(3)水體泥樣的采集提供大于5g樣本;
(4)用大體積干冰運輸,且要保證我方在收到樣品開箱檢驗時有足夠的干冰剩余。
注意:擴增子項目將2-3L水體過濾到1-2張濾膜(0.22或0.45um)后裝入到離心管中;宏基因組項目將10L水體過濾到>=2張濾膜(0.22或0.45um)后裝入到離心管中。
活性污泥與水體/地表沉積物類樣本取樣方法
(1)活性污泥
從活性污泥裝置中取大于10 ml的懸浮污泥樣本(約5-10 g沉降物),保存無菌EP管中,放入液氮或置于冰上,立即運至實驗室進行核酸提取,或-80℃保存?zhèn)溆谩?
注:若液態(tài)污泥樣本沉降物較少,可適當增加取樣量。
(2)水體/地表沉積物
取距離水底/地表0-10 cm(具體按實驗需要而定)的沉積物5~10 g,保存無菌取樣袋或EP管中,置于冰上運送至實驗室進行核酸提取,或-80℃保存?zhèn)溆?。若不能自行提取,可置于干冰寄送至公司提取?